2019年（nián）10月1日（rì），5-羟（qiǎng）甲基化（huà）胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域取（qǔ）得重（chóng）要进展。2型（xíng）糖（táng）尿病（T2D）的血管并发症（zhèng）是导（dǎo）致2型糖尿（niào）病致（zhì）残致（zhì）死的重要病因，一直缺乏（fá）一种无创便捷的临床途径实现血管并发症的发生发展监测，达到早发现、早干预，以提（tí）高T2D病（bìng）人的整体（tǐ）生活质量，减少（shǎo）卫生经（jīng）济负担。

该研究入组了（le）62例（lì）2型（xíng）糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中（zhōng）表观遗传标志物5hmC的（de）分布情（qíng）况进行（háng）检测，分析5hmC标志物与（yǔ）2型糖尿病血管并（bìng）发症发（fā）生发展（zhǎn）的（de）相关性（xìng）。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微血管事（shì）件具有相关性，主（zhǔ）要涉及一些与（yǔ）血管生（shēng）物（wù）学和糖尿病（包括胰岛素（sù）耐受和炎（yán）症反应（yīng））相（xiàng）关的基因和信号通路。该研究建（jiàn）立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准（zhǔn）确区（qū）分（fèn）有并发症和无并发症（zhèng）的2型糖（táng）尿（niào）病病人（rén）[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优（yōu）于传统临床变量例如白蛋白尿。除此之外，还建立了（le）13个基因（yīn）-5hmC标志（zhì）物组合检（jiǎn）测（cè），可以进（jìn）一步区分T2D合（hé）并单（dān）一并发症（zhèng）和多种并发症[实（shí）验（yàn）组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统临床变量。该研究（jiū）得出结（jié）论，5hmC标志物反映了T2D病（bìng）人大血管/微血管（guǎn）并（bìng）发症发生过程中（zhōng）的表观遗（yí）传变化，因而5hmC-Seal检（jiǎn）测技（jì）术在（zài）监测糖尿病血管（guǎn）并发（fā）症（zhèng）发（fā）生和（hé）进（jìn）展方面具有（yǒu）良好的临床应用前景。

本研（yán）究共纳入（rù）62例2型糖（táng）尿病病人，包括没有血（xuè）管并发症的病（bìng）人12例，有单一血管并发症（zhèng）的（de）病（bìng）人34例（24例发生大血管事（shì）件，10例发生微血（xuè）管事件），以及有（yǒu）多种血管并（bìng）发（fā）症的病人16例。试（shì）验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行二代（dài）测序，通过生物（wù）信（xìn）息学分析找出并（bìng）发症组与无并发症组之间有显著5hmC修饰（shì）差异的基因，单一并发症组（zǔ）和多种（zhǒng）并发症组之间有显著5hmC修饰差异（yì）的（de）基因。随后利用（yòng）回归模型对（duì）差异基因进一步（bù）筛选（xuǎn）、优（yōu）化，弹（dàn）性网络（luò）进一（yī）步筛选，计算加权平均（jun1）分，最（zuì）后得到一组具有高度灵敏度和特异性的5hmC生物（wù）标记（jì）物，并进（jìn）一步在实（shí）验组中验证，分析其（qí）灵敏度（dù）和（hé）特异性（xìng）。并将新建立的5hmC标志物基因组合的检测性能与传统临床变量进行对比分析。最后对相关基因进行了（le）信号通路分析（xī）和功能探究。

5hmC修饰水平与血管并（bìng）发（fā）症具有相关性

利（lì）用（yòng）逻辑回（huí）归模型对（duì）62例有并发（fā）症（zhèng）和无并发症2型（xíng）糖尿病（bìng）病人的5hmC差异水平进行分析发现，有并发症2型糖尿病病人的622个差异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归（guī）一（yī）化平均（jun1）数要明显高于无并发症的病（bìng）人（P<0.001），但是单一并发症和多发（fā）并发症病人之（zhī）间没有显著差异。

之后将有（yǒu）单（dān）一并发症或多（duō）种并发症的50例病（bìng）人用逻辑回归模型进行（háng）了（le）对比，发（fā）现多种并发症的病（bìng）人的153个差异修饰候选基因（包括上调（diào）和下调（diào）基（jī）因）的归一化平均数要（yào）低于（yú）无并发症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物可区分（fèn）有无并（bìng）发症患者

62例2型糖尿病病人被随机（jī）分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛选（xuǎn）后（hòu）发现，16基（jī）因（yīn）-5hmC标志（zhì）物组合检测可以（yǐ）用于区分有（yǒu）并（bìng）发症和无并发（fā）症的2型糖尿病病（bìng）人（rén）。

基于16基因组合（hé）模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现无并发症病人的分数在训（xùn）练集和测试集（jí）中都明显（xiǎn）低于有并发症的病人。只考虑加权平（píng）均分的话，受试者工作特征曲线（ROC）分析表明将（jiāng）cutoff值设（shè）置成0.5时，在测试（shì）组中（zhōng）中的灵敏度（dù）为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区分病人（rén）是单一并发症还是多种（zhǒng）并发症

50例有并发（fā）症的2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=25）和（hé）测（cè）试组（n=25）。利用弹性（xìng）网（wǎng）络筛选后发（fā）现，13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病病人是否发生单（dān）一（yī）并发症（zhèng）或多种并发症。

基（jī）于13基因组合模（mó）型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计（jì）算了单（dān）一并发症和多（duō）种并（bìng）发症的加权平均分（fèn），发现在（zài）训练（liàn）集和测试集（jí）中（zhōng）单一并（bìng）发症和多种并发症病人的（de）分数（shù）都（dōu）有明显差异。值得（dé）一提的是，有肾病（bìng）并发（fā）症和无肾病并（bìng）发（fā）症病人的（de）分数也有明显差异。利用加权平均分作为判断标准的受（shòu）试者工作特征曲线（ROC）表明，在（zài）测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为（wéi）87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量/危险因子的对比

我们评估（gū）了不同临床变量/危险因子（zǐ）用（yòng）于监测血管并发症的灵敏度和特异性（见表（biǎo）1）。

信号通路分析和功能（néng）探究

有并发症和无并发症病人的135个差异候（hòu）选基因的功能注释分析（xī）表明（míng），这些基因（yīn）主要（yào）富集在一些（xiē）经（jīng）典（diǎn）的信号通路（lù）。错（cuò）误发现率相关（guān）P值位于前10%和（hé）基因数（shù）目≥3的（de）信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号（hào）通路。由IGF1R和IL-10介（jiè）导的信号通路与胰岛（dǎo）素抵抗及炎症反应相关（guān），在血管生物学和糖尿病发生发（fā）展过程中发挥（huī）重要作用。

Reactome相互作用网络的中（zhōng）心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体蛋白（bái）融（róng）合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连（lián）接者。在这135个差异候（hòu）选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与（yǔ）糖尿（niào）病（bìng）病程相关的倾向，表（biǎo）明5hmC和糖尿病血管并发症之间可能存在时间依赖性的相互作用（yòng）。基于纵向时间队列的大（dà）样本（běn）研究（jiū），将可进一步明（míng）确5hmC变化和糖（táng）尿（niào）病持续时（shí）间（jiān）之间的动态关联。关（guān）于（yú）单一并发（fā）症和多种（zhǒng）并发症病人的（de）159个候选标志基因（yīn）的功能（néng）注释研究发（fā）现，存在细胞（bāo）-细（xì）胞连接（jiē）、胶原（yuán）蛋（dàn）白形成、新陈代谢、细胞（bāo）应激应（yīng）答信号通路的富（fù）集，这些信号通路均与细胞（bāo）基本（běn）功能密切相关。

血管并（bìng）发症（zhèng）是三分之二糖尿病病人的死（sǐ）亡原因，若能及早有效控制血管并发（fā）症的发生，将极大地改（gǎi）善糖尿病病人（rén）的生存质量。该研（yán）究（jiū）建立（lì）了一（yī）种利用cfDNA进行2型（xíng）糖尿病（bìng）血（xuè）管并（bìng）发症监测的无创便捷方法，较目前临床标志物能更准确（què）地（dì）监控血管并发症的发生，从而提示临床（chuáng）及（jí）早采取应对措（cuò）施，有效控制病（bìng）情进展。