2019年10月（yuè）1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病研究领域取得重要进（jìn）展。2型糖（táng）尿病（bìng）（T2D）的（de）血管并发症是导致2型糖尿病致残致死的重要病（bìng）因，一直缺乏一种无创（chuàng）便捷的临床（chuáng）途径实现血（xuè）管并发症（zhèng）的发生发展监测（cè），达到早发现、早干预，以提高（gāo）T2D病人的整体（tǐ）生活（huó）质量，减少卫（wèi）生经济负担。

该研（yán）究入组了62例（lì）2型（xíng）糖（táng）尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术对（duì）血浆cfDNA中表（biǎo）观遗传标志物5hmC的（de）分布情况进行检测，分析（xī）5hmC标（biāo）志物与2型糖（táng）尿病（bìng）血管并发（fā）症发生发展（zhǎn）的相关性。结果（guǒ）表明5hmC标志物的变化与T2D合并大（dà）血管/微血管事件具（jù）有相（xiàng）关性，主要涉及一（yī）些与血（xuè）管生（shēng）物学（xué）和糖尿病（bìng）（包括（kuò）胰岛素耐受（shòu）和炎症反应）相关的（de）基因（yīn）和信号（hào）通（tōng）路。该研究（jiū）建立的16个基因-5hmC标（biāo）志物（wù）组合检（jiǎn）测可以准确区（qū）分有并发症和无并（bìng）发症的2型糖尿病病（bìng）人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显（xiǎn）优于传统临床变量例如（rú）白蛋白尿。除此之外，还建立（lì）了13个基因-5hmC标志（zhì）物组合检测，可以进一步区（qū）分T2D合并（bìng）单（dān）一并发症（zhèng）和多种并发症[实验（yàn）组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明（míng）显优于其他（tā）传统临（lín）床变（biàn）量。该（gāi）研（yán）究得出（chū）结论，5hmC标志物反映（yìng）了T2D病人（rén）大血管/微血管并发（fā）症发（fā）生过程中的表观遗传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发（fā）症发生和进（jìn）展方面具（jù）有良好（hǎo）的临床应用前景。

本研究共（gòng）纳入62例2型糖（táng）尿病病人，包括没有血管并发症的病人12例（lì），有（yǒu）单一血（xuè）管（guǎn）并发症的病（bìng）人（rén）34例（24例发生大（dà）血管事件，10例发生（shēng）微血管事件（jiàn）），以（yǐ）及有多种血管并发症的病（bìng）人16例（lì）。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技（jì）术捕获外周血cfDNA中（zhōng）的5hmC序列，进（jìn）行二代测序，通过生物信（xìn）息学（xué）分析（xī）找出并发症组与无并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰差异的基因，单一（yī）并发（fā）症组（zǔ）和多种并发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模型对差异基因进一步（bù）筛选、优化，弹性（xìng）网络（luò）进一步筛选，计算加权平均分，最（zuì）后（hòu）得（dé）到一组具（jù）有高度灵敏度和特异性的5hmC生物标记物（wù），并进一（yī）步在实验组中验证，分析其灵敏度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基因（yīn）组（zǔ）合的检测性能与传统（tǒng）临床变量（liàng）进行对比分析（xī）。最后（hòu）对相关（guān）基因进行了信（xìn）号通路分析和（hé）功（gōng）能探究。

5hmC修饰水平与血（xuè）管并发症具有相关性（xìng）

利用逻辑回归模型对62例有并发症和无（wú）并发症2型糖（táng）尿病病人的5hmC差异水平进（jìn）行分析（xī）发现（xiàn），有（yǒu）并发症2型糖（táng）尿病病人的622个差异修（xiū）饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化（huà）平均数要明显高于无并发症的（de）病人（P<0.001），但是单（dān）一并发症和多发并发症（zhèng）病人之间没有显著差异。

之后将有单一并发症或多种（zhǒng）并（bìng）发症（zhèng）的50例病人（rén）用逻（luó）辑回（huí）归模型进行（háng）了对比，发现多种并发症的（de）病人的（de）153个差异（yì）修饰候选基因（包括上调和下（xià）调基（jī）因（yīn））的归一（yī）化平均数要低于无并发症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志物（wù）可区分有无并发症患者

62例2型糖（táng）尿病（bìng）病人（rén）被随机分成训练组（n=31）和测试组（zǔ）（n=31）。利用（yòng）弹性（xìng）网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组合检测可以用于区分有并发症和无并（bìng）发（fā）症的2型糖尿病病人。

基于16基（jī）因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平（píng）均（jun1）分分析，发现无并发症病人的分数在（zài）训练集和测（cè）试集中都（dōu）明显低于有并发症的（de）病人。只考虑加权平均分的（de）话，受试者工作（zuò）特征曲（qǔ）线（ROC）分（fèn）析表（biǎo）明将cutoff值设置成0.5时（shí），在测试（shì）组中中的灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标（biāo）志物可区分病人是单（dān）一并发症还是多种并（bìng）发症（zhèng）

50例有（yǒu）并发症的2型糖（táng）尿病（bìng）病人被随机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络筛选后发（fā）现，13基（jī）因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿（niào）病（bìng）病人是否发生（shēng）单一并发症（zhèng）或多种并发症（zhèng）。

基（jī）于（yú）13基（jī）因组合模（mó）型 (Detection Model 2)， 我们计算（suàn）了单一并发症和多种并发症的加权平均分，发（fā）现在训练集和测试集中单一并发（fā）症和多种并发症（zhèng）病人（rén）的（de）分数都有明显差异。值得（dé）一提的是，有肾病并发症和（hé）无肾病并（bìng）发症病人的分数也有明显差异（yì）。利用加权平均分作（zuò）为判断标准的受（shòu）试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试（shì）组中当（dāng）将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物（wù）与传（chuán）统临床变量/危险因子（zǐ）的对比

我们评（píng）估了（le）不同（tóng）临床变（biàn）量/危险（xiǎn）因（yīn）子（zǐ）用（yòng）于监测血管（guǎn）并发症的灵敏度和特（tè）异性（见表1）。

信（xìn）号通路分析和功能探究

有并发症和（hé）无并发症（zhèng）病人（rén）的135个差（chà）异（yì）候选基（jī）因（yīn）的功能注（zhù）释分析表明，这些基因主要富集在一些经典的信（xìn）号通路。错（cuò）误发现率相关P值位于前10%和基因（yīn）数（shù）目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的（de）信（xìn）号通（tōng）路。由IGF1R和IL-10介（jiè）导的（de）信号（hào）通路与胰岛（dǎo）素抵抗及炎症反应相关，在（zài）血管生物学（xué）和糖（táng）尿病发生发（fā）展过程中发挥（huī）重要（yào）作用。

Reactome相互作用网络的中心表（biǎo）明，泛（fàn）素（sù）编码基因[泛素B (UBB)，泛素（sù）C (UBC)，泛素A-52亚（yà）基核（hé）糖体蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是（shì）候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连（lián）接（jiē）者（zhě）。在这135个差异候选基（jī）因中, 一些（xiē）基因（yīn） （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖（táng）尿（niào）病病程（chéng）相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病（bìng）血管并发症之间可能存在时间依赖性的相互（hù）作（zuò）用。基于纵向时间队列（liè）的大样本研究，将可进一步明确5hmC变化和糖（táng）尿病持（chí）续时间之间的（de）动态关联（lián）。关于单一并（bìng）发症（zhèng）和多（duō）种并发症（zhèng）病人的159个（gè）候选标志基因的功能（néng）注释研究发（fā）现，存（cún）在细胞-细胞连接、胶原蛋白形成、新陈代谢、细胞应（yīng）激应（yīng）答信（xìn）号通路的富（fù）集，这些（xiē）信号通路均与细胞基本功能密切（qiē）相关。

血管并发症是三分之二糖尿（niào）病病人的死（sǐ）亡原因，若能及早（zǎo）有（yǒu）效控（kòng）制血（xuè）管并发症的（de）发生（shēng），将极大地（dì）改善糖尿病病（bìng）人的生（shēng）存质（zhì）量。该研究建立了一种利用cfDNA进（jìn）行2型糖尿病血管并发症监测（cè）的无（wú）创（chuàng）便捷方法，较目前临床（chuáng）标志物能（néng）更准确地监（jiān）控血管并发症的发（fā）生，从而提（tí）示临床（chuáng）及早采（cǎi）取应对措施，有效控制病情进展。